أشكال نانوية كاروتينويد من قشر الكليمنتين مثبتة بواسطة الزانثان واللثة العربية مع أنشطة مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات ومضادة للميكروبات

العائد من أصباغ الخام

أدى استخراج الأصباغ الخام من قشور الكليمنتينا المجففة إلى إنتاج 18 جرام لكل 100 جرام من الوزن الجاف، مما يشير إلى أن نظام المذيبات استعاد الكاروتينات بشكل فعال. وهذا يشير إلى أن قشور الكليمنتينا هي مصدر واعد للأصباغ الطبيعية.

محتوى أصباغ قشور الكليمنتينا

أظهرت البيانات الواردة في الجدول 1 أن الكاروتينات كانت الأصباغ الأكثر انتشارًا في القشور (30.8 مجم / كجم)، يليها إجمالي الأنثوسيانين (13.69 مجم / كجم)، بينما كان الليكوبين والأستازانتين موجودين بمستويات أقل تبلغ 3.12 و 1.6 مجم / كجم، على التوالي. قشور الحمضيات غنية بالأصباغ الطبيعية، بما في ذلك الكاروتينات القابلة للذوبان في الدهون والأصباغ القابلة للذوبان في الماء مثل الأنثوسيانين، والتي تساهم في تلوينها المميز.³⁶. هذه النتائج تتفق مع دراسة سابقة³⁷، مما يدل على أن الكاروتينات كانت الأصباغ الرئيسية في قشور الكليمنتين (8.01 ميكروغرام / مل)، تليها الأنثوسيانين (3.17 ميكروغرام / مل) وأستازانتين (0.4 ميكروغرام / مل)، مع اكتشاف الثلاثة بتركيزات أعلى في الدراسة الحالية. يمكن أن تعزى هذه الاختلافات إلى الاختلافات في أنواع الحمضيات، ونضج القشور، والظروف البيئية، وطرق الاستخراج أو التحليل. وبشكل عام، تشير المستويات المنخفضة من الليكوبين والأستازانتين إلى أن هذه الأصباغ هي مكونات ثانوية في قشور الحمضيات مقارنة بالكاروتينات والأنثوسيانين.

التوصيف الفيزيائي والكيميائي للجسيمات النانوية

التحليل الطيفي للأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR)

أظهرت البيانات في الشكل 1 القمم التي أظهرت الطبيعة المعقدة للصمغ العربي حيث بلغت قممها المميزة 3274 سم¹ (المقابلة لمجموعة –OH)، 2925 سم¹ (الموافق –CH2)، 1599 سم¹ (الموافق –C–O)، 1413 سم¹ (الموافق –CH)، 1020 سم¹ (المخصصة لـ C – O – C)، و 603 سم¹ (يشير إلى الارتباط –C–H). وتتفق النتائج مع تلك التي ذكرت سابقا³⁸. أظهر صمغ الزانثان نطاقات امتصاص عند 3282 سم¹ (تشوه محوري O – H)، 2894 سم¹ (روابط C-H تمد الاهتزازات في مجموعات الميثيل والميثيلين)، 1712 سم¹ (C=O اهتزازات التمدد)، و1603 سم¹ (التشوه المحوري للجزء C-O من الإينولات)³⁹. أظهرت مخاليط الصمغ العربي والزانثان قممًا مميزة عند 3343، 2920، 2859، 1732، 1605 سم¹1454 سم¹، 1411 سم¹1350 سم¹، 1293 سم¹، 1284 سم¹، 1067 سم¹886 سم¹و 547 سم¹، على التوالى. كشفت البيانات عن تداخل كبير في القمم من الصمغ العربي والزانثان، مما يشير إلى وجود تفاعلات كبيرة بين البوليمرين. أظهرت أصباغ الكاروتينات الأصلية نطاقات امتصاص قوية عند 3290 سم¹ (المخصصة لمجموعة O – H)، 2922 سم¹ (-CH2)، 1733 سم¹ و 1628 سم¹ (منسوب إلى مجموعات C‰=‰O وC‰=‰C، على التوالي، في الحلقات العطرية)، 1514 سم¹ و 1407 سم¹ (الموافق لاهتزازات C-O)، 1268 سم¹ (المخصصة لتمديد حلقات البيران)، 1027 سم¹ (بسبب اهتزاز استرات C-O-C) و585 سم¹ (تدل على وجود الحلقات العطرية)⁴⁰. ولذلك، فإن التحليل الطيفي للمستخلصات المركزة يظهر وجود المجموعات الوظيفية مثل –OH، C=O، C=C، وC-O-C، والتي هي من سمات الأنثوسيانين.⁴¹. أظهرت الكاروتينات النانوية قممًا مميزة عند 3367 سم¹2921 سم¹2859 سم¹1733 سم¹1604 سم¹1514 سم¹1407 سم¹، 1268 سم¹، 1071 سم¹و 585 سم¹. أكدت أطياف FTIR التحميل الناجح للكاروتينات في مصفوفة الجسيمات النانوية لصمغ الزانثان العربي/الزانثان، بشكل أساسي عن طريق الروابط الهيدروجينية والتفاعلات الأيونية الحساسة للأس الهيدروجيني، مع الحد الأدنى من التعديل الكيميائي كما هو موضح بواسطة النطاقات المميزة المحفوظة⁴².

ربما تم إنشاء النص البديل لهذه الصورة باستخدام الذكاء الاصطناعي.

أطياف التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه للصمغ العربي (أسود)، صمغ الزانثان (برتقالي)، الصمغ العربي والزانثان (الأخضر)، الكاروتينات (الأحمر)، والكاروتينات النانوية (الأزرق).

التحليل الحراري الوزني

يظهر الشكل 2 الثبات الحراري للكاروتينات وشكلها النانوي. أظهرت الكاروتينات خسارة أولية في الوزن تبلغ حوالي 10% بين 300 درجة مئوية و316 درجة مئوية، تليها خسارة إضافية تصل إلى 27% بين 563 درجة مئوية و691 درجة مئوية. عندما تم تحويل الكاروتينات إلى جسيمات نانوية، فقد فقدان الوزن بنسبة 10% بين 303 درجة مئوية و306 درجة مئوية، يليه فقدان الوزن بنسبة 27% بين 404 درجة مئوية و406 درجة مئوية. من المحتمل أن يكون فقدان الوزن المبكر في المرحلة الثانية من الشكل النانوي بسبب تبخر الرطوبة وتدهور المصفوفة البوليمرية، بينما يظل الهيكل العام مستقرًا حتى درجة حرارة 306 درجة مئوية تقريبًا.

ربما تم إنشاء النص البديل لهذه الصورة باستخدام الذكاء الاصطناعي.

التحليل الحراري الوزني للكاروتينات (الأصباغ) وشكلها النانوي (أصباغ النانو).

توزيع حجم الجسيمات

تعد الشحنة السطحية (إمكانات زيتا)، ومؤشر التشتت المتعدد (PDI)، وحجم الجسيمات من العوامل الحاسمة التي تؤثر على استقرار وفعالية الطب النانوي في توصيل الأدوية. يوضح الشكل 3 أن حجم الجسيمات النانوية الكاروتينية المنتجة يبلغ 17.05 ± 2.59 نانومتر، مما يؤكد أنها تقع ضمن نطاق مقياس النانو. أظهرت البيانات في الجدول 2 أن الشحن السطحي للكاروتينات NPs كان ±26.7 مللي فولت، وهو أعلى من +–5 مللي فولت، مما يشير إلى وجود ميل منخفض للتخثر أو التلبد في NPs الكاروتينويد المنتجة. على الرغم من أن قيمة مؤشر تعدد التشتت (PDI) البالغة 0.55 تشير إلى عدم تجانس متوسط ​​الحجم، إلا أن مستوى التوزيع هذا لا يزال مقبولاً للأداء الوظيفي. ومع ذلك، فإن تحقيق PDI أقل (-0.5) من خلال تحسين التركيبة يمكن أن يعزز توحيد الجسيمات، والتكاثر، والاستقرار على المدى الطويل، وهو اعتبار مهم للدراسات المستقبلية.³⁰.

ربما تم إنشاء النص البديل لهذه الصورة باستخدام الذكاء الاصطناعي.

توزيع حجم الجسيمات من الكاروتينات-NPs.

النشاط المضاد للأكسدة

1. 1.

   فحص DPPH

تم تلخيص نشاط مضادات الأكسدة للكاروتينات الموجودة في قشر الكليمنتين وجسيماتها النانوية والصمغ العربي وصمغ الزانثان ومزيجها في الجدول 3. وتراوح نشاط الكسح DPPH من 18.67% للصمغ الزانثان العربي عند 25 ميكروغرام/مل إلى 69.1% للكاروتينات الحرة عند 75 ميكروغرام/مل مقارنة بالتحكم. أظهر مزيج الصمغ العربي الزانثان (66.44٪) واللثة الفردية (الزانثان 64.79٪، العربي 61.49٪) أيضًا نشاطًا ملحوظًا مضادًا للأكسدة، مما يشير إلى أن هذه السكريات قد تساهم من خلال آليات التبرع بالهيدروجين أو التثبيت، وأظهرت الجسيمات النانوية الكاروتينية تثبيطًا أقل قليلاً (61.07٪) من الكاروتينات الحرة مصفوفة الجسيمات النانوية، والتي تحد من تفاعلها المباشر مع الجذور الحرة، ونتيجة لذلك، يتم إطلاق جزيئات مضادات الأكسدة تدريجيًا بدلاً من العمل مرة واحدة، مما يؤدي إلى انخفاض التثبيط على المدى القصير في الاختبار.⁴³. على الرغم من ذلك، أظهرت كل من الكاروتينات الحرة والمتناهية الصغر، وكذلك التركيبات القائمة على الصمغ، نشاطًا كبيرًا مضادًا للأكسدة، مما سلط الضوء على إمكاناتها في التطبيقات الغذائية والطبية الحيوية.

1. 2.

   فحص الفوسفو الموليبدينوم

يقوم اختبار الفوسفو الموليبدينوم بتقييم إجمالي قدرة مضادات الأكسدة (TAC) بناءً على تقليل Mo (VI) إلى Mo (V) بواسطة مضادات الأكسدة في ظل الظروف الحمضية، مما يؤدي إلى تكوين مركب فوسفات أخضر/Mo(V) قابل للقياس عند 695 نانومتر. ويعكس مدى التخفيض قدرة المركبات التي تم اختبارها على التبرع بالإلكترون. كما هو مبين في الجدول 3، أظهرت جميع العينات التي تم اختبارها نشاطًا ملحوظًا مضادًا للأكسدة، وإن كان بدرجات متفاوتة. أظهرت الكاروتينات الحرة أعلى نشاط بين المعالجات (40.52%، 43.01%، و47.75% عند 50، 100، و150 ميكروجرام/مل، على التوالي)، مقارنةً بمعيار فيتامين سي. من المحتمل أن يكون هذا النشاط القوي بسبب نظام الروابط المزدوجة المقترن من الكاروتينات، والذي يتبرع بشكل فعال بالإلكترونات لتقليل Mo (VI) وتحييد الأنواع التفاعلية. أظهرت الجسيمات النانوية الكاروتينية قيمًا إجمالية أقل لقدرة مضادات الأكسدة (TAC) (25.23-29.54٪) مقارنة بالكاروتينات الحرة. ومن المحتمل أن يكون هذا الانخفاض بسبب الانحباس الجزئي للكاروتينات داخل المصفوفة البوليمرية، مما يحد من توافرها الفوري في الاختبار ويؤخر إطلاقها. والجدير بالذكر أن الميزة الرئيسية للكبسلة النانوية ليست تعزيز نشاط مضادات الأكسدة على المدى القصير، بل حماية الكاروتينات من التدهور البيئي (على سبيل المثال، الضوء والأكسجين والحرارة) وتسهيل الإطلاق المتحكم فيه يمكن أن يؤدي هذا الإطلاق المستدام إلى تحسين الاستقرار والحفاظ على النشاط الحيوي بمرور الوقت وتوسيع تأثيرات مضادات الأكسدة في التطبيقات العملية⁴³. أظهرت البوليمرات مثل الزانثان والصمغ العربي قدرات مضادة للأكسدة معتدلة (31-38%)، ومن المحتمل أن تكون مرتبطة بمجموعاتها الوظيفية الهيدروكسيلية القادرة على تقليل النشاط المعتدل. وقد أدى مزيجها (صمغ الزانثان العربي) إلى تثبيط معزز قليلاً عند تركيزات أعلى، مما يشير إلى استقرار تآزري محتمل للكاروتينات في مصفوفة بوليمر مختلطة. وتتفق هذه النتائج مع الدراسات السابقة.^43,44، يُظهر نشاطًا قويًا مضادًا للأكسدة لمستخلصات الكاروتينات (IC₅₀ = 0.14 ملغم/مل) والتحسن بعد الكبسلة النانوية. تؤكد النتائج الحالية أن الكاروتينات هي المساهم الرئيسي في إجمالي القدرة المضادة للأكسدة لمستخلصات قشر الكليمنتين، والتي تعمل بشكل رئيسي من خلال نقل الإلكترون وآليات تحييد الجذور.

مضاد التهاب

غالبًا ما يكون الالتهاب ناتجًا عن تمسخ البروتين، مما يجعل تثبيط هذه العملية مؤشرًا رئيسيًا على الإمكانات المضادة للالتهابات. كما هو مبين في الجدول 4، أظهرت أصباغ الكاروتينات أعلى نشاط مضاد للالتهابات، مع قيم تثبيط تبلغ 69.10% و74.45% و83.87% (عند 50 و100 و150 ميكروغرام/مل على التوالي)، في حين أظهرت الكاروتينات ذات التركيبة النانوية (Carotenoid-NPs) والمصفوفات البوليمرية (الزانثان والصمغ العربي) تأثيرات معتدلة مقارنةً بالتحكم. (ديكلوفيناك الصوديوم). يمكن أن يعزى النشاط القوي للكاروتينات إلى طبيعتها القابلة للذوبان في الدهون وخصائصها المضادة للالتهابات التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا في كل من الدراسات المختبرية وفي الجسم الحي.⁴⁵. من المحتمل أن يكون النشاط المنخفض المضاد للالتهابات على المدى القصير للكاروتينات-NPs ناتجًا عن الانحباس الجزئي للكاروتينات داخل المصفوفة البوليمرية، مما يحد من توفرها الفوري للتفاعل مع وسطاء الالتهابات. ومع ذلك، فإن هذا الإطلاق التدريجي يمكن أن يكون مفيدًا، لأنه يحمي المركبات النشطة وقد يحافظ على التأثيرات المضادة للالتهابات على مدى فترة طويلة¹⁶. تم العثور على الجزء الغني بالأنثوسيانين لمنع تنشيط NF-ÎoB الناتج عن IL-1β في خلايا Caco-2 الظهارية المعوية، في حين أن الجرعات البالغة 50 و100 ميكروغرام/مل قللت من تنشيط NF-ÎoB بنسبة 68.9 و85.2% على التوالي.⁴⁶. أظهرت دراسة سابقة تغيرات كبيرة في النشاط المضاد للالتهابات للأنثوسيانين بتركيزات مختلفة (50-150 ميكروغرام / مل)، في حين كان الحد الأقصى لسجل التثبيط 52.13٪، والذي شوهد من الأنثوسيانين عند 150 ميكروغرام / مل. وقد ثبت أن اللايكوبين يقلل من تقدم مجمع TLR4 / المحول على الغشاء، والذي يمكن أن يعزى إلى انخفاض انتقال TLR4 إلى الدهون طوف⁴⁷. قد يتداخل اللايكوبين مع اتصال TLR4 بالمحولات، مما يؤدي إلى إلغاء تنشيط TLR4، ويمنع بشكل كبير تحفيز NF-ÎoB وإنتاج NO/IL-6 الذي ينتجه LPS.⁴⁸. بالإضافة إلى ذلك، فقد خفض تكوين مجمع TLR4 باستخدام MyD88 أو TRIF. علاوة على ذلك، تم تصنيع جزيئات الذهب النانوية من الحمضيات سينينسيس مستخلص قشر الفاكهة يوقف بشكل فعال تمسخ الزلال الناتج عن الحرارة. عند تركيز 50 ميكروجرام/مل، لوحظ أعلى تثبيط بنسبة 76.64%، مما يشير إلى أن جزيئات الذهب النانوية يمكن أن تمنع تمسخ البروتين، مما يساهم في الالتهاب.^49,50.

نشاط مضاد للميكروبات

تمت دراسة النشاط المضاد للبكتيريا لأصباغ الكاروتينويد لقشور الكليمنتين وشكلها النانوي مقارنة بالصمغ العربي وصمغ الزانثان وخليط الزانثان والصمغ العربي. أظهرت البيانات في الجدول 5 أن خليط الزانثان والصمغ العربي تم تثبيطه ب. المخيعية، مسجلاً تثبيط منطقة قدره 10.3 ملم، تليها أصباغ كاروتينويد، مسجلاً تثبيط منطقة قدره 8.3 ملم، على التوالي. بخصوص المكورات العنقودية الذهبيةأشارت النتائج إلى تثبيط أصباغ الكاروتينات و NPs الخاصة بها المكورات العنقودية الذهبية، مسجلاً منطقة تثبيط قدرها 9.0 و 8.7 ملم على التوالي. تم تثبيط كل من أصباغ الكاروتينات والصمغ العربي L. المستوحدة، مسجلاً تثبيط منطقة قدره 21.3 و 21.0 ملم على التوالي. الصمغ العربي يمنع أيضا الإشريكية القولونية و S. التيفيةمما تسبب في منطقة تثبيط 13.0 و 12.7 ملم على التوالي. كما تم تثبيط أصباغ الكاروتينات الإشريكية القولونية و S. التيفية، تظهر منطقة تثبيط 10.0 و 11.0 ملم على التوالي. كشف خليط من الزانثان والصمغ العربي عن منطقة تثبيط P. aeruginosa 9.3 ملم، يليه الصمغ العربي وحده، مما يمنع P. aeruginosa بمقدار 9.3 ملم. وأظهرت السيطرة الإيجابية، سيفترياكسون، فرقا كبيرا (ص<<0.05) من أصباغ الكاروتينات وNPs والبوليمرات المستخدمة لجميع البكتيريا التي تمت دراستها. تشير الفعالية المعتدلة للكاروتينات الحرة وشكلها النانوي إلى إمكاناتها كعوامل طبيعية مضادة للميكروبات، خاصة في حفظ الأغذية أو التطبيقات الطبية الحيوية حيث يكون الإطلاق المتحكم فيه والتوافق الحيوي مفيدًا. تدعم هذه النتائج أيضًا فكرة أن الكبسلة النانوية يمكن أن تحافظ على النشاط الحيوي مع تقديم فوائد إضافية مثل الحماية من التدهور والتحرر المستدام بمرور الوقت.²².

تم تقييم النشاط المضاد للفطريات لأصباغ الكاروتينات، ومصفوفاتها النانوية، ومصفوفات السكاريد (الصمغ العربي والزانثان) ضد العديد من الأنواع الفطرية (الجدول 6). يمنع خليط الزانثان والصمغ العربي جيم المبيضة، تظهر منطقة تثبيط تبلغ 12.0 ملم، تليها أصباغ كاروتينويد، والتي تمنع جيم المبيضة بواسطة منطقة تثبيط مسجلة 9.7 ملم. أظهر صمغ الزانثان نشاطًا مضادًا للفطريات عاليًا ومثبطًا أ. فلافوس مع منطقة تثبيط عرض 17.0 ملم. يمنع صمغ الزانثان وحده، وخليط من الزانثان والصمغ العربي أ. النيجر مع تسجيل منطقة تثبيط 11.7 و 10.0 ملم على التوالي. وفي الوقت نفسه، أظهرت أصباغ الكاروتينات وصمغ الزانثان منطقة تثبيط مماثلة أ. أوكراسيوس، تسجيل 10.0 ملم. الفطريات P. verrecosum تم تثبيته بواسطة الصمغ العربي وخليط من الزانثان والصمغ العربي، مما أظهر منطقة تثبيط تبلغ 20.0 و18.3 ملم، على التوالي. يمنع الصمغ العربي وحده F. verticillioides وأظهرت منطقة تثبيط قدرها 15.7 ملم. في أثناء، واو أوكسيسبوروم تم تثبيته بواسطة NPs كاروتينويد، مما يدل على منطقة تثبيط مسجلة 14.7 ملم. وأظهرت السيطرة الإيجابية، ميكونازول، فرقا كبيرا (ص<<0.05) من أصباغ الكاروتينات و NPs والبوليمرات المستخدمة في جميع الفطريات التي تمت دراستها باستثناء ف. verticillioides و واو أوكسيسبوروم.

ووفقا للتقارير، فقد وجد أن الصمغ العربي له خصائص مثبطة ضد S. التيفية, ب. المخيعية, المكورات العنقودية الذهبية, الإشريكية القولونيةوحتى جيم المبيضة، و أ. النيجر^51,52. تم استخدام الصمغ العربي بنجاح كحامل لمستحضرات عشبية أخرى مضادة للميكروبات (مستخلص الثوم أو القرفة) لبناء طبقة مضادة للبكتيريا على الأطعمة، على الرغم من أن نشاطه المضاد للميكروبات نادرًا ما يُلاحظ. كان للزانثان-أوليغوساكاريد تأثير مضاد للجراثيم المكورات العنقودية الذهبية، في حين أشارت آلية العمل إلى أنها لا تقلل من نفاذية غشاء الخلية فحسب، بل تمنع أيضًا تطور الأغشية الحيوية والكالسيوم.₂⁺-ملغ₂⁺-نشاط ATPase على المكورات العنقودية الذهبية الغشاء الخلوي⁵³. وأظهرت الدراسة السابقة أن قشور الحمضيات والكاروتينات لها تأثير مضاد للميكروبات عالي ضد البكتيريا والفطريات المختلفة. يمكن أن تعزى حساسية البكتيريا موجبة الجرام لهذه الأصباغ وتركيبات النانو والصمغ البوليمر إلى بنية جدار الخلية السميكة الكارهة للماء للبكتيريا، مما يسهل التفاعل مع هذه المركبات^54,55. كما أظهرت أصباغ الكاروتينات تأثيراً قوياً المكورات العنقودية الذهبية⁵⁶.

تعد سلامة الأغذية مصدر قلق كبير في إنتاج الأغذية الحديثة، حيث أن التلوث بمسببات الأمراض والكائنات الحية الدقيقة الفاسدة يمكن أن يشكل مخاطر صحية كبيرة. وهذا يدل على أن إضافة الكاروتينات إلى طرق تغليف المواد الغذائية أو حفظها يمكن أن يساعد في تقليل التلوث الميكروبي وزيادة مدة الصلاحية.^57,58. يكتسب استخدام المركبات الطبيعية لحفظ الأغذية شعبية حيث يبحث العملاء عن بدائل للمضافات الاصطناعية. تعمل كاروتينات قشر الكليمنتين المستقرة مع الزانثان والصمغ العربي على زيادة توافرها الحيوي وكفاءتها، مما يجعلها مادة حافظة طبيعية واعدة.